Die T4-DNA-Ligase katalysiert die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem benachbarten 5'-Phosphat und 3'-Hydroxyl am stumpfen oder kohäsiven Ende der dsDNA. Es kann auch die Verknüpfung von RNA mit ssDNA oder RNA in doppelsträngigen Nukleinsäuren katalysieren. Sie kann jedoch keine Verknüpfungen zwischen einzelsträngigen Nukleotiden katalysieren. Die T4-DNA-Ligase kann für die Markierung des 3'-Endes von RNA, die Zyklisierung von RNA- und DNA-Oligonukleotiden, das Klonen von cDNA und andere Manipulationen von Nukleinsäuren verwendet werden.
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