Bilirubin wird durch diazotierte Sulfanilsäure in farbiges Azobilirubin umgewandelt und photometrisch gemessen. Von den beiden Bilirubinfraktionen im Serum - Bilirubinglucuronid und freies, an Albumin gebundenes Bilirubin - reagiert nur ersteres direkt, während freies Albumin reagiert, nachdem es durch einen Beschleuniger vom Protein verdrängt wurde. Aus der Differenz der beiden Messungen von Gesamtbilirubin (mit Beschleuniger) und direktem Bilirubin (ohne Beschleuniger) lässt sich das indirekte Bilirubin berechnen.
Die Begriffe "direktes" und "indirektes" Bilirubin beziehen sich ausschließlich auf die Reaktionscharakteristika in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Beschleunigers oder Lösungsvermittlers und sind nur ungefähre Äquivalente der beiden Bilirubinfraktionen.
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