Testkit für Forschungszwecke LS-K268

GesamtproteinATPAdenosinmonophosphat

Die 5-AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) ist ein wichtiger Sensor für den intrazellulären Energiehaushalt. AMPK wird als Reaktion auf einen Anstieg des AMP/ATP-Verhältnisses aktiviert, der durch eine Reihe von Faktoren wie Muskelkontraktion, Hunger oder Hypoxie verursacht werden kann. AMPK ist ein heterotrimerer Proteinkomplex, der aus Alpha-(63 kDa), Beta-(38 kDa) und Gamma-(38 kDa) Untereinheiten besteht. Für jede Untereinheit sind Isoformen identifiziert worden (alpha-1, alpha-2, beta-1, beta-2, gamma-1, gamma-2, gamma-3), die theoretisch die Bildung von 12 verschiedenen Proteinen ermöglichen. Die Alpha-Untereinheit enthält eine Serin/Threonin-Kinasedomäne und die regulatorischen Untereinheiten enthalten Bindungsstellen für AMP und ATP sowie für Glykogen. AMPK wird durch Phosphorylierung an Thr-172 innerhalb der katalytischen Domäne aktiviert. Die Bindung von AMP führt zu einem 2- bis 5-fachen Anstieg der AMPK-Aktivität im Vergleich zum Basalniveau. Die Bindung von AMP an die Alpha-Untereinheit bewirkt eine allosterische Aktivierung der Kinase und führt zu einer Konformationsänderung in der Kinasedomäne, die AMPK vor der Dephosphorylierung von Thr-172 schützt. Dieser zellbasierte ELISA misst die phosphorylierte AMPK in ganzen Zellen und normalisiert das Signal auf den Gesamtproteingehalt. Der Antikörper erkennt beide Alpha-Untereinheiten und kann daher für Zellen aus allen Geweben (Mensch, Maus, Ratte) verwendet werden. Dieser einfache und effiziente Assay macht die Vorbereitung von Zelllysaten überflüssig und kann zur Untersuchung der AMPK-Regulation in Kurzzeit- und Langzeit-Assays verwendet werden. Bei diesem Assay werden die in 96-Well-Platten gezüchteten Zellen fixiert und in den Vertiefungen permeabilisiert. Die AMPK-Phosphorylierung (pAMPK) wird mit einem fluoreszierenden ELISA gemessen, gefolgt von einer Messung des Gesamtproteins in jeder Vertiefung.